霉变谷物中毒

 

黄曲霉毒素M1（AFM1）定量酶联免疫检测试剂盒说明书

ELISA-kit for Aflatoxin M1

 

本测试盒用间接竞争免疫分析法定量测定奶及奶制品中黄曲霉毒素M1。该测试盒反应孔可拆卸，可测单份样品，也可测多份样品。定量分析时需有含450nm波长的微孔板酶标仪。

 

1 概要

黄曲霉毒素是曲霉菌属的高毒代谢产物，是一种强烈的致癌物；黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的代谢产物，是通过喂食动物带有黄曲霉毒素B1的饲料而分泌到奶中的。检测黄曲霉毒素M1的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等。HPLC法灵敏度较高，结果稳定，但所需仪器设备昂贵，样品准备耗时长，不适于大量样品的筛选；TLC法为目测半定量，并且需要大量接触毒素标准品，不利于操作者健康。用此黄曲霉毒素M1 ELISA检测试剂盒可快速、准确地检测出奶及奶粉中的黄曲霉毒素M1的含量是否超出国家标准及国际标准。我国鲜乳中黄曲霉毒素M1限量标准是0.5 µg/kg(500 ppt)。

 

2 测定原理

本测试盒用固相酶联免疫吸附原理，利用间接竞争ELISA法进行测定。用抗原包被微孔板，加入黄曲霉毒素M1标准品或样品、抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体进行免疫反应后，将未与包被抗原结合的抗体洗去；再加入酶标记的抗鼠IgG抗体孵育，加入底物显色，终止液终止反应后，用酶标仪在450nm处测定OD值。

 

3 提供的试剂

微孔板  包被有AFM1-BSA

5个浓度的AFM1毒素标准溶液（0，0.02，0.05，1，2ng/mL）各1mL，直接使用

AFM1抗体溶液（6mL）.….….….….….….….….…………………直接使用，红色帽

酶标物(1mL).….. .….….….….….….….….….……………………… 使用时按要求稀释

酶稀释液(12mL)….. .….. .….. .….. .…. .….….….….….….….….….直接使用，绿色帽

显色剂(12mL).….. .….. .….. .….. .….. .….. .….….….….….….…. …直接使用，蓝色帽

终止液(6mL)………. .….. .….….….….….….….….….….….. . ………直接使用，黄色帽

浓缩洗涤液(10mL) ...….……….….. .….. .….. .….….….….…使用时按要求稀释，白色帽     

 

4 盒中未提供，需自备物品

4.1 设备

微孔板酶标仪（含450nm）：定量分析用，

分析天平，微量移液器，刻度量筒，冷冻离心机

4.2 试剂

去离子或水蒸馏水

 

5 操作者注意事项

----标准溶液中含有黄曲霉毒素M1，应特别小心。

----使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素M1溶液最好用pH7的次氯酸溶液（10%v/v）浸泡过夜。

----终止液为1N硫酸，避免接触皮肤。

----不要使用过了有效日期的试剂盒。

----不要交换使用不同批号盒中的试剂。

 

6  储存条件

----保存试剂盒于2-8℃。不要冷冻

----显色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

----将不用的微孔板放进原铝箔袋中，置2-8℃保存。

 

7 试剂变质的标志

----0ng/mL标准的吸光度值小于0.6个单位 (A450nm<0.6)时，表示试剂可能变质。

 

8 样品处理

样品应当保存在阴凉避光之处或冷藏保存

8.1 牛奶

----取牛奶样品，用冷冻离心机（4000rpm，10℃）离心10分钟去除脂肪；如无冷冻离心机，可先将样品冷却到10℃，再离心

----用吸液管彻底去除上层奶油

----取50μL脱脂牛奶用于分析

8.2 奶粉

----用分析天平称取10g奶粉（精确到0.01g）

----加100mL去离子水或蒸馏水，震荡5分钟，充分溶解

----余步骤按照8.1牛奶样品

注意：样品的量可能由于条件所限需要增加或减少，但体积比必须保持一致。

 

9  酶标免疫分析程序

9.1测定之前注意事项

1.    使用之前将所有试剂回升至室温20-30℃

2.    使用之后立即将所有试剂放回2-8 ℃

3. 每步加样时间控制在5min。

4. 孵育过程中应避光。

 

9.2 试剂稀释

1. 酶标物稀释：酶标物稀释液与酶标物按体积比19:1稀释。

2. 浓缩洗涤液稀释：使用时用去离子水或蒸馏水与本浓缩液按体积比9:1稀释。

 

9.3 测定程序

1. 根据样品数量将足够数量的板条插入微孔架，记录样品及标准的位置。

2. 加入50mL标准品或处理好的样品到微孔，每个标准和样品必须使用新的吸头。

3. 加入50mLAFM1单克隆抗体使用液到每个微孔（注意移液器管尖不要接触到放进孔中的液体，避免交叉污染）37℃孵育60min。

4. 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板3min×3次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。

5. 加入酶标物100mL，37℃孵育30min。

6. 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板3min×3次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔      中液体。

7. 加入显色剂100mL, 37℃孵育10min。

8. 加入终止液50mL，立即用酶标仪测定吸光度值（OD值）。

 

10 定量分析

以标准溶液OD值与0ng/mL OD值的比值为纵坐标，所对应标准溶液浓度（ng/mL）的对数值为横坐标，制作标准曲线。求得样品OD值与0ng/mL标准OD的比值，从曲线上得到对应点的横坐标，即为AFM1浓度的对数值，求得反对数即为测定液中AFM1浓度C（ng/mL），

1）牛奶中AFM1含量：从曲线上得出的AFM1浓度值（ng/mL）即为牛奶中AFM1含量(μg/kg)。

2）按下列公式计算奶粉样品中AFM1含量：

奶粉中黄曲霉毒素M1含量（mg/kg）= C×K

式中：C：测定液中AFM1含量（ng/mL）

            K：测定液对样品的稀释倍数（本提取方法为10）

 

11试剂盒主要技术指标及参数

 测试盒最低检出浓度0.07ng/mL，回收率70%-130%，与黄曲霉毒素B1交叉反应系数小于10%，与黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2交叉反应系数小于1%，试剂盒校正曲线的线性范围0.02ng/mL -2ng/mL，试剂盒条内变异＜10%，条间变异＜15%。

 

附图（仅供参考）

文本框: 吸光度比值                 

                            浓度对数（ng/mL）

                         黄曲霉毒素M1标准抑制曲线

 

 

 

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